行业资讯 | 辉瑞-BNT新冠疫苗非临床研究解读

2021年8月23日，FDA正式批准Pfizer-BioNTech 新冠疫苗，商品名为COMIRNATY，在10月5日，FDA更新了COMIRNATY的批准历史、信函、审查和相关文件。笔者整理翻译了COMIRNATY注册时提交的非临床研究方法和结果供相关从业人员参考。

非临床药理学

小鼠的免疫原性（研究报告：R-20-0085）

实验方案：

4组8只雌性BALB/c小鼠（至少6周龄）在第0天用0.2、1和5μg BNT162b2或缓冲液（对照组）通过肌内注射进行一次免疫。免疫后第7、14、21和28天采集血液，并通过ELISA和pVNT分析抗体免疫应答。在第28天，收集脾脏进行脾细胞分离，并使用IFNγELISpot分析T细胞反应。此外，还进行了Luminex分析和细胞内细胞因子染色（ICS）以评估细胞因子反应。

实验结果：

结果表明，BNT162b2在小鼠中具有高度免疫原性，具有强抗原结合IgG和高滴度中和抗体反应，以及Th1表型CD4+反应以及单次免疫后的IFNγ⁺、IL-2⁺、CD8⁺T细胞反应。总IgG ELISA显示，该疫苗诱导了强烈的剂量依赖性IgG反应，可识别S1和RBD。免疫后7天，所有各组动物均可检测到IgG抗体，抗体总量增加直到第28天。所有小鼠在免疫后14天开始产生功能性中和抗体，滴度增加，直到最后一个研究日。

此外，通过分析IgG亚型，在两个较高剂量（1和5μg）下检测到平衡的IgG2a/IgG1应答，而低剂量诱导的应答的IgG1水平高于IgG2水平（0.2μg）。用S蛋白特异性重叠肽池刺激新鲜脾细胞显示出强大的CD4⁺和CD8⁺T细胞IFN-γ反应，并且在相应培养上清液中细胞因子（IL-2和IFN-γ）的定量中显示出Th1显性谱。

大鼠的免疫原性（研究报告：38166和20GR142）

实验方案：

在38166和20GR142研究中，雌雄Wistar Han大鼠分别连续3周，每周肌内注射1次100μg BNT162b2（V8）或30μg BNT162b2（V9）*。这两项研究分别在第17天（第3次给药后两天）和第38天（研究结束）采集血清样本。对于研究38166，通过ELISA分析血清中结合S1和RBD的IgG以及SARS-CoV-2-S假病毒中和抗体。对于研究20G142，仅对血清进行SARS-CoV-2中和活性分析。

* V8和V9指的是BNT162b2的两种变体，变体8和变体9。V8和V9仅在密码子优化序列上不同，但表达相同的氨基酸序列。

实验结果：

在用BNT162b2（V8）免疫后，动物产生了高滴度的抗原特异性抗体以及中和滴度。BNT162b2（V9）在给药结束和研究恢复阶段，也在雌雄大鼠中诱发SARS-CoV-2中和抗体反应。在接种疫苗前的动物或盐水对照动物中未观察到SARS-CoV-2中和抗体反应。

非人灵长类动物的免疫原性和SARS-CoV-2攻毒挑战（研究报告：VR-VTR-10671）

免疫原性实验方案：

在恒河猴中评估BNT162b2的免疫原性和对传染性SARS-CoV-2攻毒挑战的保护作用。在第0天和第21天，用30或100μg BNT162b2或生理盐水（对照）免疫2-4岁雄性恒河猴。在该研究中，38份SARS-CoV-2人类康复期血清（HCS，取自18至83岁的SARS-CoV-2感染者，至少在PCR确诊后14天，以及个体无症状时）被用于评估疫苗体液免疫反应质量的当前评估基准。

攻毒实验方案：

两组2-4岁的雄性恒河猴分别接受间隔21天的两次100μg BNT162b2 V9（n=6）或生理盐水（对照组；n=3）肌内注射免疫，在第二次免疫55天后，用1.05×10⁶个斑块形成单位的SARS-CoV-2（菌株USA-WA1/2020）通过鼻内（IN）和气管内（IT）进行攻毒挑战。然后通过RT-qPCR检测支气管肺泡灌洗液（BAL）、鼻拭子和口咽拭子中SARS-CoV-2 RNA的存在。

免疫原性实验结果：

S1结合IgG和SARS-CoV-2中和抗体（由NT50滴度确定）在单次免疫后14天即可检测到，并且在第二次免疫后水平进一步显著升高。第28天，即第2次给药后7天，30μg剂量水平下，中和几何平均滴度（GMT）达到38人份HCS中和GMT的8倍；100μg剂量水平下，GMT是HCS中和GMT的18倍。第56天观察到S1结合IgG水平和中和滴度下降，但仍高于HCS中和GMT和S1结合几何平均浓度（GMC）。如小鼠免疫后所见，在第二剂30或100μg剂量的BNT162b2后，所有免疫的恒河猴中检测到强烈的S-特异性Th1显性INFγ⁺，但最小的IL-4 T细胞反应。通过细胞内细胞因子染色分析，S-特异性CD4⁺T细胞反应呈剂量依赖性增加，频率出现的INFγ⁺、IL-2⁺或TNF-α⁺细胞证明具有强烈的Th1偏倚。值得注意的是，在BNT-162b2免疫的动物中也可检测到CD8⁺T细胞反应。

攻毒实验结果：

在所有3只对照免疫动物的BAL液中检测到病毒RNA（第3天2只，第6天1只）；然而，在BNT162b2免疫的动物中未检测到病毒RNA。在所有测试时间点（第1天、第3天和第6天）可在大多数对照免疫动物的鼻拭子和口咽拭子中检测到病毒RNA，而BNT162b2免疫的恒河猴仅在激发后第1天检测到病毒RNA，在第3天及以后未被检测到。所有受试动物均未表现出明显疾病的临床症状，这表明2-4岁雄性恒河猴试验模型是SARS-CoV-2感染模型，而不是COVID-19疾病模型。未观察到疫苗引起疾病增强的影像学证据。

非临床药代动力学（PK）

实验目的：

评估LNP中两种新型脂质赋形剂（ALC-0315和ALC-0159）的PK和代谢以及BNT162b2的潜在生物分布。

•ALC-0315：((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)

• ALC-0159：2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide

实验方案：

1）在■小鼠中使用■表达作为替代报告来评估BNT162b2的生物分布。■表达modRNA的配方类似于BNT162b2，具有相同的脂质成分。小鼠肌肉注射总剂量为2μgLNP/只，并在注射后6小时、24小时、48小时、72小时、6天和9天测量体内■的表达。

2）用■LNP在■大鼠中进行了组织分布研究，LNP同样由BNT162b2脂质成分和编码■mRNA的专利混合物组成。试验品还含有微量放射性■，这是一种不可交换、不可代谢的脂质标记物，用于监测LNP的分布。受试动物（21只雄性和21只雌性）分别接受单次肌内注射，靶mRNA总剂量为50μg/只。在给药后0.25、1、2、4、8、24和48小时（3只动物/性别/时间点）采集全血和组织样本。

3）大鼠■PK研究使用与BNT162b2相同的脂质成分中配制的编码■modRNA，以评估ALC-0315和ALC-0159脂质的药代动力学。雄性大鼠单次给药1 mg/kg剂量后，收集336小时内血浆样本。

4）在小鼠、大鼠、猴子和人类的血液、肝微粒体、S9和肝细胞中进行了ALC-0315和ALC-0159体外代谢评估，在PK大鼠研究的血浆、尿液、粪便和肝脏样本中检测体内代谢。

实验结果：

1）■小鼠注射部位在注射后6小时检测到■表达，9天后未检测到■表达。注射后6小时，肝脏中检测到少量■表达，注射后48小时检测不到。

2）■大鼠肌内注射■LNP后所有时间点，注射部位的■浓度最高。注射部位之外，血浆中的放射性水平在给药后1-4小时达到峰值，并在48小时内主要分布在肝脏、肾上腺、脾脏和卵巢。肝脏的放射性总回收率最高，脾脏的总回收率较低，肾上腺和卵巢的总回收率很低。两性的平均浓度和组织分布模式相似。

3）ALC-0315和ALC-0159从血浆分布到肝脏。ALC-0315和ALC-0159的血浆浓度迅速下降，初始t_1/2分别为1.62和1.72小时。ALC-0315和ALC-0159从血浆中清除的终末消除t_1/2分别为139和72.7小时的。分布到肝脏的剂量比分别为ALC-0315约60%和ALC-0159约20%。虽然在尿液中未检测到任何一种脂质的排泄，但在粪便中排泄比例为ALC-0315约1%，ALC-0159约50%。